内蒙古农大: 喷洒复合益生菌可提高仔猪生长能力和免疫力, 调节仔猪的肠道菌群和血液代谢物

导读

环境微生物暴露是影响新生儿早期肠道菌群建立的一个因素，而益生菌的应用已被证明可以促进仔猪的健康和生长。因此，本研究假设在生命早期应用环境益生菌对新生仔猪有益，进而研究在仔猪的生活环境中喷洒复合益生菌发酵液(CPFL)对其早期生长能力和免疫力的影响。本研究共纳入68头仔猪，随机分为益生菌组和对照组，并在0、3、7、14和21日龄收集血液和粪便样本进行检测和分析。结果表明喷洒CPFL显著重塑了产房的环境微生物组成，增加了仔猪的日增重和断奶重(P<0.001)，并调节了仔猪的血清细胞因子水平(IgA、IgG和IL-10水平增加；IFN-γ水平减少；P<0.05)。此外，在仔猪出生初期喷洒CPFL改变了仔猪的肠道菌群结构以及多样性，增加了一些潜在有益菌的丰度(如Bacteroides uniformis、Butyricimonas virosa、Parabacteroides distasonis和Phascolarctobacterium succinatutens)，降低了Escherichia coli丰度(P<0.05)。喷洒CPFL还显著提高了肠道微生物的生物活性潜力和维生素(B2、B3、B6和E)、二羧酸(壬二酸和癸二酸)以及中/长链脂肪酸(己酸、十四烷酸和十七烷酸)代谢相关的几种血清代谢物的水平。总之，喷洒CPFL可以显著提高仔猪的生长性能和免疫力，其有益效果与肠道菌群和宿主代谢的变化有关。本研究为今后开发基于益生菌的健康促进策略提供了新的依据，并提高了益生菌在畜牧业中应用的认识。

论文ID

原名：Spraying compound probiotics improves growth performance and immunity and modulates gut microbiota and blood metabolites of suckling piglets

译名：喷洒复合益生菌可提高仔猪生长性能和免疫力，调节仔猪的肠道菌群和血液代谢物

期刊：Science China-Life Sciences

IF：10.372

发表时间：2022.12.16

通讯作者：张和平

通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

DOI号：10.1007/s11427-022-2229-1

实验设计

使用来自内蒙古农业大学的乳酸菌培养库中三种不同的细菌菌株：Lactobacillus caseiZhang (LCZ)，Lactobacillus plantarum P-8 (P-8)和Lactobacillus rhamnosus Probio-M9 (Probio-M9)经过培养、发酵得到高密度的复合益生菌发酵液(CPFL)。实验对象是从两组品种相同、体重相近、批次相同的临产母猪中分别选择56头，分为益生菌组和对照组。CPFL经适当稀释后喷洒在益生菌组的母猪产床和仔猪活动区(产床地板和围栏)，每天上午9:00和下午3:00各喷洒一次，喷洒时间为分娩前两天至分娩后七天。在0、7和14日龄收集产房内的环境样本、以及在0、3、7、14和21日龄收集仔猪的粪便和血液样本。最终益生菌组和对照组分别有32和36头新生仔猪完成所有采集工作。对环境和粪便样品进行宏基因组测序，经过质控、去宿主之后进行组装得到MAG(对其注释、计算丰度)，使用MelonnPan-predict管道生成预测的肠道代谢物谱。仔猪血清代谢物采用Agilent 6545A Q/TOF的正负离子模式进行质谱分析。将识别的差异标志物与血液暴露数据库进行比较，以确定最佳注释结果。使用Pearson相关系数进行相关分析，R软件和AI环境进行统计分析和数据可视化。

图1 实验设计图

前言

仔猪的胃肠道结构和功能在出生后迅速适应从肠外营养(通过胎盘)向肠内营养(初乳、牛奶)的过渡，这个过程伴随着源于生活环境、母猪阴道、皮肤和粪便的微生物的动态定植。新生仔猪肠道菌群的建立对仔猪的生长和身体健康有着至关重要的影响，因为它通过多种宿主-微生物的相互作用影响着胃肠道的发育和成熟、机体代谢平衡和免疫防御机制。因此，在生命的最初几天，常规的早期益生菌干预(如使用乳酸菌属和双歧杆菌属)可能会改善肠道菌群的定植，以及新生哺乳动物的生长、发育和抗病能力。研究表明，益生菌可以改善养殖动物的生长能力、降低腹泻率、增强免疫功能以及预防疾病。尽管许多研究报道了在养猪业中使用益生菌的积极效果，但从不同的研究中得出的推论基本是不一致的，可重复性相当低。此外，人们对益生菌发挥作用的内在机制还不甚了解，益生菌的效果也会受到益生菌菌种和剂量的影响，同时，与宿主相关的生理和环境因素也可能影响补充益生菌对健康的促进作用。因此，有必要评估候选益生菌在畜牧业中的具体效果。

研究表明，与单菌种补充相比，补充多种益生菌菌种对宿主健康、免疫力、病原体防御和其他生物功能产生了协同有益影响。其中，益生菌菌株LCZ、P-8和Probio-M9，最初分别从马奶酒、自然发酵的酸奶和健康女性的母乳中分离出来。包含这三种菌株的复合益生菌混合物已被用于多项临床试验，显示出对维持长期航行者的肠道物种多样性的有益作用。假设新生仔猪早期在环境中接触混合益生菌制剂，将通过调节肠道菌群和血液代谢物来提高其生长能力和免疫功能。在此基础上，本研究评估了在母猪及其新生仔猪的生活环境中直接喷洒复合益生菌发酵液(CPFL：含有LCZ、P-8和Probio-M9)的健康促进作用(仔猪生长能力和免疫功能)。同时，进一步分析益生菌驱动的仔猪微生物组和血液代谢物生物标志物的变化以及动物健康的改善。为益生菌在改善哺乳仔猪的生长发育、抗病能力和免疫成熟度方面的应用提供了全面的参考信息，拓展了我们对以益生菌为基础的新生动物管理知识的认识。

结果

1、喷洒益生菌发酵液提高了仔猪的生长能力

2、喷洒益生菌发酵液重塑产房的环境微生物群组成

此外，鸟枪法宏基因组测序通过将宏基因组数据集的读长映射到每个菌株的参考基因组上，来追踪粪便样本中补充的益生菌菌株，即LCZ、P-8和Probio-M9。在3日龄和7日龄，这三种益生菌菌株的基因组丰度在益生菌组中逐渐增加，而在对照组中则没有，这表明摄入的益生菌可以很容易地通过上消化道并在仔猪肠道中被检测到(图S2c)。

图3 仔猪粪便宏基因组数据的微生物多样性和SGBs特征。(A、B)益生菌组(Pro)和对照组(Con)在0、3、7、14和21日龄时的Shannon指数(A)和主坐标分析(PCoA)评分图(B)。以不同颜色显示的符号代表两组样本。(C)益生菌组和对照组在不同时间点的仔猪粪便宏基因组中12个主要SGB(相对丰度>1%)的分布。不同颜色代表12种主要SGB的丰度随时间的变化。(D)在不同时间点益生菌组和对照组之间差异SGB的丰度。浅绿色代表对照组，橙色代表益生菌组。用Wilcoxon检验评估统计差异；用Benjamini-Hochberg校正P值；*P<0.05；**P<0.01。(原文图2)

4、喷洒益生菌发酵液调节仔猪血清免疫球蛋白和细胞因子水平

为了揭示喷洒CPFL对仔猪免疫力的影响，监测了血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)的水平。与对照组相比，在益生菌组的仔猪血清中检测到明显更多的IgG(在大多数时间点)、IgA(在14和21日龄)和IL-10(在21日龄)(P<0.05；图4)。相反，益生菌组在7、14和21日龄检测到的IFN-γ明显较少(P＜0.05；图4)，呈现出随时间推移而下降的趋势。此外，对照组的仔猪血清IL-6水平上升(特别是0日龄相比于7、14和21日龄；P<0.05)，而益生菌组则没有上升。与3日龄相比，14日龄和21日龄的仔猪在CPFL干预后血清TFN-α水平明显下降(P<0.05；表S2)。这些结果强调了CPFL的应用对仔猪免疫力的影响。

图4 益生菌组(Pro)和对照组(Con)在不同时间点血清免疫球蛋白和细胞因子水平的变化。使用Wilcoxon检验评估组间IgG、IgA、IFN-γ、IL-6、IL-10和TNF-α水平的差异。(原文图3)

5、喷洒益生菌发酵液调节仔猪的肠道代谢物

利用MetaCyc和KEGG数据库进行了以基因组为中心的代谢重建，以确定387个SGBs中编码肠道代谢物的变化。在功能注释中，重点关注与维生素、神经递质、氨基酸和短链脂肪酸有关的模块。最终确定的肠道代谢模块属于13个不同的门，主要是厚壁菌门(57.10%)、拟杆菌门(21.96%)和变形菌门(8.53%)。三个最主要的模块(流行率>80%的SGBs)是醋酸合成I(94.57%)、硫胺素生物合成III(82.43%)和谷氨酸合成I(80.36%；表S3)。此外，益生菌组的肠道微生物组富含丙酸盐合成III、丁酸盐合成I和维生素B6生物合成I等模块，而对照组的肠道微生物组则是以半胱氨酸降解I模块为代表(表S4)。

使用MelonnPan对仔猪粪便样本的肠道代谢物进行预测，共鉴定了80种代谢物。首先，在肠道微生物组和代谢组之间观察到良好的相关性(相关性=0.6933，P=0.001，Procrustes分析；图S3a)，揭示了干预期间预测的肠道代谢物和SGBs之间的相互作用。这些预测的肠道代谢物随着仔猪的年龄增长而显示出明显的变化(图5A)，特别是在7、14日龄(图5B，5C)，益生菌组和对照组之间的肠道代谢物呈现显著差异(P<0.02，Adonis检验；图5D)。分析预测了25种差异代谢物(在3日龄和7日龄分别有3种和22种差异代谢物)，这些代谢物只在后来的时间点在两组之间表现出明显的丰度差异，但在0日龄时没有显著差异(表S5)。其中一些预测的代谢物，包括烟酸、吡多胺、己酸、壬二酸、癸二酸、胆红素、N-乙酰谷氨酸、谷氨酸、肾上腺酸、尿嘧啶、胆甾烯酮和C20:4肉碱等，在益生菌组的水平明显高于对照组(P<0.05；图5E)。

图5 试验期间预测的益生菌(Pro)和对照组(Con)中肠道代谢物的变化。主坐标分析(PCoA)得分图显示了两组仔猪在(A)所有时间点、(B)7日龄和(C)14日龄时预测的肠道代谢物的变化。(D)通过Adonis检验评估不同时间点益生菌组和对照组之间仔猪肠道代谢物的统计学差异。(E)通过小提琴图比较对益生菌干预有反应的预测差异肠道代谢物的丰度。使用Benjamini-Hochberg校正Wilcoxon检验的P值，校正后P<0.05被认为具有统计学意义。(原文图4)

6、喷洒益生菌发酵液对仔猪血清代谢组的调节作用

为了进一步揭示CPFL处理后仔猪的生理反应，在出生时和断奶时监测其血清代谢组的变化。代表质量控制(QC)样本的符号在PCA图上紧密聚集，表明LC-MS系统和测量血清代谢物的条件高度稳定，生成的数据可用于后续分析(图S3b)。代表两组血清代谢组的符号在出生时密切聚类，但在断奶时发现明显的基于组别的聚类趋势(图6A；P＜0.001)，表明断奶时益生菌驱动的血清代谢组发生明显变化。在偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型中，两组之间确定了18种不同丰度的血清代谢物(VIP>2；图6B)。将其与血液暴露组数据库进行了比较，注释了11个代谢物。此外，与对照组相比，在断奶时益生菌组富集了几种代谢物(如核黄素、维生素E、十四烷酸和十七烷酸)(P<0.03；图6C)。两组仔猪断奶时血清代谢组的显著变化表明，出生前至出生后喷洒CPFL可以对仔猪产生特定的生理影响。

图6 益生菌组(Pro)和对照组(Con)在0日龄和21日龄时血清代谢组的比较。(A)益生菌组和对照组在0日龄和21日龄时血清代谢组的主坐标分析(PCoA)。正负离子模式分别为ESI⁺和ESI^-。***，P<0.001，Wilcoxon检验。(B)通过LC-MS检测到的益生菌组和对照组在0和21日龄时的显著差异代谢物。这些代谢物仅在21日龄时呈现出显著差异，而在0日龄时则没有差异(临界VIP值>2；P<0.05)。热图显示了这些代谢物的相对丰度。(C)用箱线图比较了益生菌组血清差异代谢物的水平。使用Benjamini-Hochberg校正Wilcoxon检验的P值，校正后P<0.05被认为具有统计学意义。(原文图5)

7、多组学研究发现，喷洒益生菌发酵液可提高仔猪的生长能力和免疫力

首先，通过关联分析探讨了仔猪生长能力、免疫因子、肠道菌群和肠道代谢物之间的关系(表S6)。结果显示，Clostridium scindens、Sutterella sp.和Phascolarctobacterium succinatutens与仔猪体重呈正相关(r>0.4)，而Faecalimonas umbilicata和Escherichia coli呈负相关(r<-0.40)。Sutterella sp.与IgG呈正相关(r=0.42)，而烟酸(r=-0.41)和吡哆胺(r=-0.42)与Escherichia coli呈负相关。此外，一些肠道代谢物，如壬二酸、癸二酸和谷氨酸，与仔猪体重呈正相关(r>0.40；图S3c)。

讨论

有研究表明，施用益生菌可以提高仔猪生长能力，减少感染性腹泻，并降低新生仔猪的死亡率。因此，本研究调查了喷洒特定配方的CPFL(在分娩前施用，直到出生后的早期几天)对仔猪从出生到断奶期间健康状况的有利影响。同时，利用多组学技术监测了伴随健康改善的多个参数的变化。结果表明益生菌处理可以对哺乳仔猪的生长和健康产生较大影响，这些变化也伴随着肠道微生物组和血清代谢组的调节(图7)。

图7 益生菌发酵液提高仔猪生长性能和免疫功能的拟定模型。益生菌发挥的有益效果伴随着特定微生物和血液代谢物的变化。VB2、VB3、VB6、VE、MCFAs分别代表维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素E和中链脂肪酸。(原文图6)

肠道菌群在先天免疫系统的发展中起着至关重要的作用。研究检测了IgG、IgA、IL-10、IL-6、TFN-α和IFN-γ等指标，以评估应用CPFL对仔猪免疫的影响。经CPFL处理的仔猪中IgA和IgG等保护性抗体水平增加，表明益生菌可以增强这些动物体液的特异性免疫力，同时血清IFN-γ和TNF-α等一些经典促炎因子减少。此外，在21日龄时，益生菌组的血清IL-10水平明显高于对照组，并且在实验过程中呈现出上升趋势。这些结果表明，喷洒CPFL可以增强免疫力，降低仔猪的炎症反应。

结论