PHARMACOL RES: 抗生素诱导的肠道菌群损耗加剧宿主高胆固醇血症

时间：2022-12-12 来源：微生态作者：微生态浏览次数：3060

导读

高胆固醇血症是动脉粥样硬化的主要驱动因素，导致了全球高发病率和高死亡率的发生。肠道微生物群已被确认为血脂(包括胆固醇水平)的调节剂。少数研究已经将部分细菌和微生物机制与宿主胆固醇相联系，然而在特定的小鼠模型中，根据遗传学和实验方法所得到的结果却是相互矛盾的。为进一步了解肠道细菌和宿主胆固醇代谢之间的关系，我们首先在一个人群队列(n=24)中进行了粪便16S rRNA靶向宏基因组测序，结果显示高胆固醇血症患者的肠道微生物群组成发生改变，包括双歧杆菌(Bifidobacteria)减少、梭菌(Clostridia)增加以及厚壁菌门/拟杆菌门比例增加。为检测对肠道微生物群的药物干预是否会影响宿主血清胆固醇水平，我们使用口服非吸收性抗生素治疗高胆固醇血症载脂蛋白E基因敲除(ApoE KO)小鼠。结果显示，当小鼠正常饮食且在随机喂食状态下测量血清胆固醇时，抗生素增加了血清胆固醇水平，由其引起的胆固醇升高在治疗开始后几天就已经发生，并且在停止抗生素并重新获得肠道细菌后是可逆的。基因表达分析表明，喂食状态下抗生素介导的肠道胆固醇摄取增加。非靶向血清代谢组学表明，植物甾醇水平降低和胆汁酸循环减少均与微生物机制有关。综上所述，本研究进一步揭示了肠道微生物群与宿主胆固醇代谢之间的关系；抗生素对肠道微生物群的药理破坏能够加重血清胆固醇并可能影响心血管疾病。

图文摘要

论文ID

原名：Antibiotic-induced gut microbiota depletion exacerbates host hypercholesterolemia

译名：抗生素诱导的肠道菌群损耗加剧宿主高胆固醇血症

期刊：Pharmacological Research

IF：10.334

发表时间：2022.11.21

通讯作者：Massimo Federici

通讯作者单位：意大利罗马第二大学

DOI号：10.1016/j.phrs.2022.106570

实验设计

结果

1 高血清胆固醇患者肠道微生物群组成发生改变

本研究通过16S核糖体rRNA靶向宏基因组测序分析了不同血清胆固醇水平患者的肠道微生物群组成。所有患者均未服用降胆固醇药物。本研究队列分为低胆固醇水平组(LC)(血清总胆固醇范围为124-203 mg/dL)及高胆固醇水平组(HC)(血清总胆固醇范围为207-258 mg/dL)个体。两组患者血清LDL胆固醇和Apo B水平存在差异(P＜0.001，表1)，但HDL胆固醇、甘油三酯及Apo A1均没有变化。HC患者平均及最大颈动脉内膜-中层厚度进一步增加(表1)，包括体重指数在内的其他基线特征均没有显著变化(表1)。

为了比较LC和HC组间粪便微生物群落结构分类差异，同时考虑到分类的层次结构，我们使用非参数Wilcoxon秩和检验进行热树分析，发现在HC患者中厚壁菌门(Firmicutes)增加，且是由梭菌目(Clostridiales)增加所介导的。相反，与LC相比，HC患者中属于放线菌门(Actinobacteria)的双歧杆菌目(Bifidobacteriales)大幅减少(图1a、b，S1a)。考虑到这两组间top OTU差异，双歧杆菌属(Bifidobacterium)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)以及瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)是先前观察结果的最主要驱动因素(图1c)。我们发现HC患者体内拟杆菌门(Bacteroidetes)的数量没有显著减少，但这导致了厚壁菌门与拟杆菌门的比率(Firmicutes/Bacteroidetes)显著升高(P＜0.05，S1b)。此外，两组之间α多样性没有差异(S1c)。

表1.患者基线特征

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分类变量采用双侧t检验或卡方检验分析。数据为平均值±标准差。加粗字体表示差异显著即P < 0.05。Apo：载脂蛋白；BMI：身体质量指数；GFR：肾小球滤过率；HbA1c：糖化血红蛋白；HDL：高密度脂蛋白；HOMA-IR：稳态模型胰岛素抵抗指数；IMT：内膜中层厚度；LDL：低密度脂蛋白；PCSK9：前蛋白转化酶枯草溶菌素9；RAAS：肾素-血管紧张素-醛固酮系统。

图1. 高、低血清胆固醇患者中肠道微生物群差异分析(n=24)。(a)热树显示群落结构差异，节点和边缘的大小及颜色与每个群落中生物丰度相关。标记显著的分类单元名称(Wilcoxon秩和检验P＜0.05)；(b)纲水平丰度分析。*Wilcoxon秩和检验P＜0.05。(c)显著(P<0.05)操作分类单元(OTU)的热图。

2 抗生素增加正常饮食ApoE KO小鼠的血清胆固醇

鉴于LC和HC患者粪便的分类学差异，我们研究了微生物群靶向药物干预对血清胆固醇水平的影响。此前我们已经报道了在禁食状态下测量ApoE KO小鼠血清胆固醇时，口服抗生素治疗不会改变其血清胆固醇。然而，在这项研究中，我们重复了在随机喂食状态下血清胆固醇的测量，我们发现，口服抗生素会加重正常饮食(ND)小鼠的总胆固醇水平，而不是西方高胆固醇饮食(WD)小鼠的胆固醇水平(图2a)。为了证实这一观察结果，我们对血清脂蛋白进行了靶向高效液相色谱分析，包括亚类和粒径。结果显示，ND患者的低密度和极低密度脂蛋白胆固醇因抗生素而增加，而WD患者则没有显著变化(图2b、c，表2)。ND患者中乳糜微粒亚类(＞90 nm)和高密度脂蛋白胆固醇(~7.6 nm)也因使用抗生素而略微增加(表2)。虽然WD患者中脂蛋白甘油三酯未被抗生素改变，但我们发现抗生素导致了WD患者中游离甘油的增加(图2b、C，表2)。

图2 动脉粥样硬化载脂蛋白E基因敲除小鼠脂质谱分析(n = 6,7只/组)。(a)喂食状态下的总血清胆固醇；(b)高分辨率血清脂蛋白胆固醇谱；(c)高分辨率血清脂蛋白甘油三酯谱，包括游离甘油；(d)乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)胆固醇和游离甘油的详细分析。HDL：高密度脂蛋白；ND：正常饮食；WD：西方饮食；UT：未处理；ABX：抗生素处理；双因素方差分析(Tukey事后检验)，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001，^****P＜0.0001。

N=6-7/组。单位：mg/dL。使用2-way ANOVA及Tukey事后检验分析。正常饮食未处理与抗生素处理相比：^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001(显著加粗)；未处理的正常饮食与西方饮食相比：^# P < 0.05,^##P < 0.01, ^###P < 0.001；西方饮食未处理与抗生素处理相比：^§P < 0.05。CM：乳糜微粒；VLDL：极低密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；HDL：高密度脂蛋白。

3 抗生素引起血清胆固醇升高发生迅速且可逆

先前的观察是在长期使用抗生素治疗的小鼠中进行(抗生素治疗10周)。我们对ApoE KO小鼠进行连续研究，结果表明血清胆固醇的变化在抗生素治疗72小时后即可发生(图3a)。为证明血清胆固醇依赖于完整的肠道微生物菌群，我们对口服抗生素的ApoE KO小鼠进行了一系列的胆固醇测量(图3b)。开始使用抗生素后，小鼠血清胆固醇水平在6周治疗期间加剧(所有时间点P＜0.001，图3b)。随后停止使用抗生素，并更换笼子间的垫料，在肠道微生物群重新恢复后，两组小鼠的胆固醇水平重新同化(P＞0.999，图3b)。

图3. 载脂蛋白E基因敲除小鼠中血清胆固醇对抗生素反应随时间变化的分析。(a)短期使用抗生素(ABX)治疗后血清胆固醇的变化，n=12，通过双侧配对t检验分析****P＜0.0001；(b)抗生素使用前、使用期间和停止使用(再定植)后血清胆固醇的变化。数据为平均值±标准差，n=6–12，^***P＜0.001。

4 抗生素影响肠道胆固醇代谢基因的表达

小肠和肝脏是维持胆固醇稳态的关键器官。为揭示抗生素引起血清胆固醇升高的机制，我们通过RT-qPCR对长期口服抗生素(ND或WD)的ApoE KO小鼠小肠和肝脏中与脂质代谢相关的基因进行了基因表达分析。热图结果显示，在肝脏中，饮食对基因表达有很大影响，而抗生素仅调节少量基因(图4a)。相反，在小肠中，抗生素显著影响ND和WD中的基因表达，特别是与肠道脂质代谢相关的常见基因，例如Nr1h3、Serbf1和Cd36均在抗生素处理后增加(图4a)。同时部分与胆固醇代谢相关的基因在ND和WD中也因抗生素处理而增强(Sbrebf2、Lldr、Hmgcr)(图4b)，而大多数胆固醇代谢基因仅在ND中因抗生素而增强(Npc1l1、Pcsk9、Cyp27a1、Cyp51、Hmgcs1)(图4b)。

图4.载脂蛋白E基因敲除小鼠在不同饮食和抗生素处理下肝脏和肠道代谢基因的表达。(n=6/组)。(a)肝脏和肠道中脂质代谢相关基因的热图分析；(b)肠道中胆固醇代谢相关基因。ND：正常饮食；WD：西方饮食；UT：未处理；ABX：抗生素处理；^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001，使用2-way ANOVA与Tukey事后检验。

5 抗生素可调节血清中植物甾醇和胆汁酸的水平

随后我们研究了抗生素可能引起血清胆固醇升高的代谢变化。在先前的研究中，对与饮食无关的血清代谢组变化将抗生素治疗、动脉粥样硬化的加剧相关联已经进行了评估。在本研究中，我们评估了抗生素作用下与胆固醇代谢相关的代谢物的变化(图5a)。通过非靶向代谢组学测定的游离胆固醇证实了先前的结果(图5b)，然而，抗生素并没有改变胆固醇的合成，其前体3-羟基-3-甲基戊二酸水平不变(图5b)。有趣的是，在WD组中未检测到植物甾醇β-谷甾醇和菜油甾醇，但在ND中由于抗生素处理而显著减少(图5c)。此外，我们观察到ND患者经抗生素治疗后胆固醇通过胆汁酸排泄减少的趋势，表现为7α-羟基-3-氧代-4-胆甾烯酸(7-HOCA) (P =0.0645)、初级胆汁酸胆盐(P=0.0658)、β-muricholate(P＜0.05)以及次级胆汁酸脱氧胆酸(P=0.0812)、牛磺脱氧胆酸 (P = 0.0521)、熊去氧胆酸、7-酮基脱氧胆酸(P<0.05)减少(图5d、e)。4-胆甾烯-3-酮（粪甾醇的前体）保持不变（图5d）。

图5. 载脂蛋白E基因敲除小鼠血清代谢组学分析胆固醇代谢产物(n=6-7/组)。(a)通路；(b)游离胆固醇及其前体；(c)植物甾醇；(d)胆固醇的分解代谢产物；(e)胆汁酸。ND：正常饮食；WD：西方饮食；UT：未处理；ABX：抗生素处理；^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

讨论

肠道微生物群被认为是血脂的重要贡献者，因此影响着心血管疾病。在这项研究中，我们比较了低、高水平血清胆固醇个体中肠道微生物群的组成。在高胆固醇个体中观察到Clostridia增加，Bifidobacteriaceae则减少。胆固醇和Clostridia增加的联系在之前的研究中已经描述过，而超重伴血脂异常的患者则表现为Bifidobacteriaceae减少。Bifidobacteriaceae先前已被证明可以降低肥胖小鼠中的胆固醇水平。在文献中已经描述了数种细菌降低胆固醇的机制，包括胆固醇同化、胆汁酸通过胆盐水解酶转化为粪固醇以及细菌化合物对宿主胆固醇代谢酶的调节。我们没有观察到肠道微生物群多样性的差异，但是微生物基因丰富度和多样性的缺失与代谢综合征患者胆固醇水平的升高有关。

此前，我们发现抗生素引起的肠道微生物群耗竭导致动脉粥样硬化小鼠模型的疾病发展，同时与饮食无关的色氨酸和脂肪酸代谢调节是抗生素导致动脉粥样硬化的潜在驱动因素。禁食状态下使用抗生素没有发现血清胆固醇发生变化。此前对抗生素和无菌小鼠的研究显示胆固醇水平与基因敲除模型、饮食背景及实验方案有关。即使是在基因相似的小鼠中，个体间微生物群的差异以及动物设施之间的微生物群差异也可以解释某些确定表型缺乏再现性。在本研究中，我们重复了在随机喂食状态下对胆固醇的测量，结果表明在正常饮食的小鼠中，抗生素引起的药理学微生物群耗竭显著增加了血清胆固醇水平，而西方饮食则没有改变。我们发现抗生素治疗几天后，胆固醇的变化于早期发生，停止抗生素治疗后减少，说明胆固醇的升高是可逆的。禁食和进食状态之间的差异可以解释为膳食摄入时微生物胆固醇的利用受到干扰。在西方饮食的背景下，抗生素增加胆固醇的作用可能会被高胆固醇饮食所抵消。膳食胆固醇可能会对肠道的整个运输体系造成压力，因此，抗生素介导的肠腔中额外的胆固醇可能不会转化为更高的血清胆固醇水平。这一假设得到以下事实的支持：在西方饮食中，抗生素会增加肠道Ldlr、 Hmgcr及Srebf2的表达，但血清胆固醇水平保持不变。另一种解释也有可能是本研究中使用的西式饮食中植物甾醇缺乏(或其含量很低)所导致。虽然在正常的饮食中检测到了高水平的植物甾醇，但我们没有在西方饮食的动物血液中检测到任何植物甾醇(不论抗生素治疗与否)。在正常饮食中，抗生素治疗显著降低了血清中植物甾醇水平，这可能会影响肠道对胆固醇的摄取。随机对照实验清楚表明，在饮食中添加植物甾醇时具有降低胆固醇的作用。植物甾醇可与胆固醇竞争性吸收并调节胆固醇转运蛋白Niemann-pick C1-like。在本研究中，抗生素引起的肠道中该转运蛋白及其它胆固醇代谢相关基因的增加可能由植物甾醇的较少所介导。近年来，研究发现短链脂肪酸(SCFA)丙酸盐调节Niemann-pick C1-like转运蛋白，并影响人和小鼠的胆固醇水平。此前，我们观察到正常饮食中抗生素引起SCFA代谢产物减少的趋势，因此，这一机制可能有助于本研究中观察到的结果。

此外，抗生素对胆汁酸循环的改变可能在胆固醇稳态中发挥作用。未经治疗的正常饮食状态中胆汁酸的含量最高，而抗生素治疗的西方饮食状态下则有所减少。次级胆汁酸是通过微生物脱偶联和脱羟基作用形成的，主要是Bifidobacteria、Clostridia和Bacterioidia。先前已证明在ApoE KO小鼠中，肠道细菌的缺乏(无菌条件)可调节胆汁成分并影响小鼠的血液胆固醇水平，可能的机制包括成纤维细胞生长因子(FGF)-15/FGF受体4的激活、肝脏胆固醇7α-羟化酶的降低以及胆汁酸合成的减少。虽然胆汁酸循环减少会影响血清胆固醇水平，但次级胆汁酸也可能通过法尼醇X受体和武田G蛋白偶联受体5的多效性作用影响动脉粥样硬化。

本研究存在局限性，虽然显示了高胆固醇血症患者肠道微生物群组成的差异变化，但没有阐明这些变化是否转化为血清胆固醇水平的改变。本研究中的小鼠模型补充了其他研究，揭示了血清胆固醇对肠道菌群的明显依赖。然而，由于肠道微生物群组成不同、小鼠和人类具有不同的胆汁酸代谢及其他因素如饮食摄入等，导致这些结果可能无法适用于人类。例如，在我们的小鼠实验中，未经治疗的正常饮食组几乎不存在双歧杆菌科，因此，正如我们的人体数据所表明的那样，抗生素对这些细菌的消耗不会显著影响胆固醇水平。抗生素已被证明能够减少所有共生细菌，其中大部分属于厚壁菌门和拟杆菌门。在本研究中，高胆固醇受试者表现出从拟杆菌门拟杆菌门到厚壁菌门的显著转变。拟杆菌的缺失可能是我们人类研究和小鼠抗生素模型之间的一个共同特征，可用于解释胆固醇的变化。最近发现拟杆菌门成员通过微生物胆固醇磺基转移酶调节宿主胆固醇。有趣的是，过去发现厚壁菌门与拟杆菌门比例(Firmicutes/Bacteroidetes)升高与肥胖相关，我们认为这可能也是高胆固醇血症的特征之一。

综上所述，和Heianza等人观察到的一样，我们提供的证据表明肠道微生物群的药理破坏对宿主代谢产生负面影响，并可能在抗生素使用与心血管疾病的关联中发挥作用。我们认为细菌植物甾醇的利用和胆汁酸代谢改变对肠道胆固醇摄取的影响导致抗生素治疗小鼠血清胆固醇水平的升高。同时胆固醇的升高取决于饮食背景及禁食状态。在高胆固醇血症患者中，我们发现肠道微生物组发生了变化，这可能导致胆固醇水平升高。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1043661822005163

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