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内蒙古农大孙天松教授团队揭示鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9可延长秀丽隐杆线虫的寿命(国人佳作)

时间:2022-11-03 来源:微生态 作者:九卿臣 浏览次数:1754

导读


益生菌被认为有助于维持宿主肠道菌群的平衡并对健康产生影响,但很少有研究关注它们在延缓宿主衰老方面的潜力。本研究发现健康母乳益生菌鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9(Lacticaseibacillus rhamnosus Probio-M9)可增强模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的运动能力,减缓其肌肉功能衰退。活菌状态的Probio-M9以不依赖饮食限制的方式显著延长线虫寿命通过筛选各种与衰老相关的线虫突变体,发现Probio-M9通过p38级联反应和daf-2信号通路延长寿命,不依赖daf-16,但依赖于skn-1Probio-M9通过激活线粒体未折叠蛋白反应来保护和修复受损的线粒体细菌代谢产物中氨基酸、鞘磷脂、半乳糖和脂肪酸的显著增加可能与线虫寿命的延长有关。本研究揭示了Probio-M9作为一种膳食补充剂具有延缓线虫衰老的潜力,也为进一步分析益生菌在改善宿主健康和延缓衰老相关慢性疾病发生方面提供了新的方法和见解。


论文ID

名:Lacticaseibacillus rhamnosus Probio-M9 Extends the Lifespan of  Caenorhabditis elegans

鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9延长秀丽隐杆线虫寿命

期刊Communications Biology

IF6.548

发表时间:2022.10.27

通讯作者:孙天松

通讯作者单位:内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室

DOI号:10.1038/s42003-022-04031-2
实验设计

本实验在20℃下的线虫生长培养基(NGM)琼脂平板上进行线虫培养,Probio-M9和LGG在37℃的MRS肉汤中厌氧培养24 h,连续培养三代作为实验菌液。E. coli OP50在37℃ Luria-Bertani(LB)肉汤中摇床孵育12 h。之后制备菌板:对照组:E. coli OP50,实验组:Probio-M9悬浮于E. coli OP50,取40 μL涂布于60 mm培养皿。使用L4后期的线虫作为t = 0进行寿命测定。虫卵在OP50或OP50+Probio-M9上培养至L4后期后进行细菌选择实验。将20个卵放置在20个培养皿上,作为t = 0进行生命周期分析;将20条L4后期的同步化雌雄同体虫每天转移到新鲜培养皿中评估其后代数目;从成虫的第1-5天随机挑取20条进行体型分析。从成年后第2-14天选择不同年龄段线虫进行吞咽频率测定。从成年后的8-16天选择不同年龄段线虫测量其运动能力。第10天或第15天用M9缓冲液冲洗3次,麻醉后在激光扫描显微镜下获得荧光图像后进行脂褐质积累实验。第5天在34℃下暴露,分别于12 h、18 h和24 h后测定其存活率,评估其耐热性。线虫放入M9缓冲液中,研磨后用M9缓冲液连续稀释线虫裂解液,MRS培养基培养后进行肠道细菌CFU的测定。线虫麻醉染色后在激光扫描显微镜下获得荧光图像后评估线粒体膜电位的影响。利用超高效液相色谱-质谱进行代谢组学分析,以确定OP50和Probio-M9之间的差异调节代谢物。


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图1 实验设计图

心血管疾病、神经退行性疾病、癌症等疾病的发病率和死亡率与年龄呈正相关。因此,延长寿命和延缓衰老受到了广泛关注。许多研究都聚焦于特定饮食和营养资源在抗衰老中的关键作用,特别是益生菌的补充。活的益生菌在摄入足量时具有对人体健康有益的功能。研究表明,益生菌可通过改善肠道微生物平衡、增强免疫调节和/或与病原体竞争等方式促进宿主健康。然而,益生菌延长宿主寿命的机制在很大程度上仍不清楚。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)由于其生命周期短、通体透明、易于观察和不存在伦理问题等优势广泛应用于抗衰老研究中。调节线虫衰老过程的基因包括脊椎动物中发现的一些经典和保守的信号通路。p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是线虫最古老的进化保守通路之一。在人类中,p38级联反应通常被炎症细胞因子和病原体入侵激活。在线虫中,p38级联反应被NSY-1 MAPK激酶、SEK-1 MAPKK激酶和PMK-1激活。胰岛素/胰岛素样生长因子1(IGF-1)信号通路(IIS)的一些保守成分也调节衰老。由老年基因daf-2编码的唯一胰岛素/IGF-1受体是IIS的关键上游成分,调节线虫的各种生理过程,如衰老和成年寿命。daf-2的寿命延长作用是通过daf-16/FOXO转录因子在daf-2(e1370)等降低的胰岛素信号突变体中介导的。SKN-1是一种应激反应性核转录因子,有助于缩短IIS相关寿命。此外,细菌代谢物分泌的某些物质,如荚膜异多糖酸、胍丁胺和丙酮醛,已被确定为对宿主寿命有重大影响的关键因素。

线粒体功能对衰老过程有着深远的影响。研究表明,线粒体功能障碍对线虫的寿命产生有利影响。导致电子传输链(ETC)功能障碍的突变可将线虫寿命延长50%。线粒体未折叠蛋白反应(UPRmt)也与促进健康和线粒体内稳态有关。当转录因子ATFS-1因线粒体应激而从线粒体穿梭到细胞核时,UPRmt被激活。
在本研究中,探讨了从健康母乳中分离的鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9对线虫寿命、运动能力和脂褐素积累等生理功能的影响。Probio-M9显著延长线虫寿命30%。利用线虫的各种与衰老相关的突变体,包括p38 MAPK、营养感应信号通路和UPRmt,研究了Probio-M9延长寿命的分子机制。结合Probio-M9代谢产物的差异表达,揭示了Probio-M9延缓宿主衰老的可能代谢途径。这些数据揭示了益生菌与宿主寿命之间的重要联系,为益生菌的持续开发提供了新的见解,并表明膳食中补充益生菌可能有延缓宿主衰老的潜力。


结果


1、 Probio-M9延长秀丽隐杆线虫的寿命


Probio-M9和E. coli OP50属于不同的细菌属,据报道,当用其他细菌替代E. coli OP50时,线虫具有选择偏好性。因此,将Probio-M9沉淀重悬在E. coli OP50溶液中,以排除其偏好性。在本研究中,将E. coli OP50与Probio-M9的比例约为1:4(活菌板计数分别为6.8×10CFU/mL和2.82×109CFU/mL)作为实验组(OP50+Probio-M9),单独使用E. coli OP50作为对照组(OP50)。首先采用2种检测模式对线虫喂食细菌选择行为进行检测分析。将虫卵在OP50(补充图1a)或OP50+Probio-M9(补充图1c)上培养到L4后期,然后转移到OP50或OP50+Probio-M9上1h或2h。结果表明,每个平板上的线虫数量相似(补充图1b,d),说明线虫在OP50和OP50+Probio-M9之间不产生选择偏好性。此外,进行了二元选择实验。将虫卵在OP50(补充图1e)或OP50+Probio-M9(补充图1g)上培养到L4后期,然后转移到含有OP50和OP50+Probio-M9的两个细菌圈的板上。同样,喂食1h或2h后,每个菌圈中的线虫数量没有显著差异(补充图1f,h)。这些结果表明,线虫对OP50+Probio-M9没有表现出任何回避行为或偏好。综上所述,Probio-M9可以作为线虫食物供应的良好补充剂。


接下来,评估了Probio-M9对线虫寿命影响。同步化L4后期线虫从OP50转移到OP50+Probio-M9或继续在OP50上培养,每天测定存活率,直到所有线虫死亡。结果表明,OP50+Probio-M9显著延长线虫寿命约30% (图2a和补充表1)。当Probio-M9在细菌混合物中的比例发生变化(稀释或增加)时,仍然可以观察到寿命延长(图2b和补充表1),但以OP50:Probio-M9 (OP50+Probio-M9)1:4的比例为最佳,说明Probio-M9的有益作用是剂量依赖性的。

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图2 喂食Probio-M9对线虫寿命调节的影响。a Probio-M9显著延长野生型N2线虫寿命(p<0.0001)。b 最佳剂量Probio-M9 (OP50+4 Probio-M9)可显著延长野生型N2线虫寿命(p<0.0001)。较低(OP50+0.04 Probio-M9和OP50+0.4 Probio-M9)或较高(OP50+40 Probio-M9)的Probio-M9对寿命延长影响较小(p<0.05)。在a和b中,三次独立重复实验,并在单个实验中测试了90条OP50或OP50+Probio-M9喂养的线虫。OP50和Probio-M9用量分别为6.8×108CFU/mL和2.82×109CFU/mL。(原文图1)


2、Probio-M9对线虫具有促进健康的作用


众所周知,饮食限制(DR)会延缓线虫发育,从而延长其寿命。为了研究Probio-M9对线虫生长发育的影响,我们研究了线虫的生命周期、后代数目和体型大小。在OP50+Probio-M9上培养不影响达到繁殖年龄所需的时间、繁殖能力或周期(图3a-c),也不影响线虫的体型大小(图3d)。此外,还研究了DR信号通路在线虫寿命延长中的作用。发现OP50+Probio-M9仍然延长eat-2(ad1116)和aak-2(ok524)突变线虫的寿命(图3e,f和补充表2)。总之,这些数据表明,用Probio-M9喂养线虫对其生长发育没有影响,表明Probio-M9以与DR无关的方式延长线虫的寿命。
秀丽隐杆线虫肌肉功能的下降和脂褐素的积累与衰老密切相关。为了研究Probio-M9喂养是否可能改善这些生理功能,测量了三种与衰老相关的经典表型。两组线虫的咽泵速率随年龄的增长而逐渐下降,而OP50+Probio-M9在幼龄期第2、4天的咽泵速率无显著差异,但在成年期第6~14天的咽泵速率下降明显延迟(图3g)。与咽泵速率的变化一致,OP50+Probio-M9喂养也延缓了线虫正常运动能力的下降(图3h)。此外,与喂养OP50的线虫相比,喂养OP50+Probio-M9的线虫在成年期第10天和第15天脂褐素(一种在衰老细胞中积累的自荧光化合物)的积累显著减少(图3i,j)。这些发现表明,喂养Probio-M9可以维持较高的肌肉质量,增强年老线虫的身体功能。

由于寿命和抗应激性是相互关联的,研究了Probio-M9对线虫抗物理(温度)应激的影响。在成年第5天,喂食OP50+Probio-M9的线虫在暴露于34℃高温下18或24 h后,存活率显著高于喂食OP50的线虫(图3k)。这表明,Probio-M9对线虫的热稳定性有积极影响。总之,喂养Probio-M9可改善线虫健康并延长其寿命。

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图3 Probio-M9具有促进健康的作用。a-d 在OP50和OP50+Probio-M9上生长的野生型N2线虫的生命周期(从卵到第一次产卵)(a)、总子代数、(b)、繁殖周期(c)和体型(d)没有显著差异(N=20,p>0.05,t检验)。e,f 喂食Probio-M9的DR信号通路突变体eat-2(ad1116)(e)和aak-2(ok524)(f)的生存曲线(N = 90只,p<0.0001,对数秩检验)。g OP50+Probio-M9培养的野生型N2线虫在第2~14天的咽泵率较OP50培养的野生型N2线虫有所提高(N=20只,p<0.01,双因素方差分析)。h 在第8-16天测定生长在OP50和OP50+Probio-M9上的野生型N2线虫的正常运动能力。根据线虫的运动,将其分为四类:A类,正常运动,自发和/或节律正弦运动(蓝条);B类,不能移动身体,动作不规则和/或不协调(橙条);C类,动作不协调/行动迟缓,在铂金捡丝器适度触摸时,只移动头部和/或尾巴(绿条);D类,死虫(红条)(N≥90只,p<0.05,卡方检验)。i,j 野生型N2线虫的脂褐素积累在喂食OP50+Probio-M9后减弱。在FV1200共聚焦显微镜下观察第10天或第15天脂褐素的积累,比例尺为20 μm (i),用ImageJ软件(j)测量荧光强度。结果以任意单位(a.u)表示(N=34只,p<0.001,t检验)。k 在OP50+Probio-M9上培养的野生型N2线虫的耐热性比在OP50上培养的存活率更高。将OP50或OP50+Probio-M9培养的成虫第5天从20℃转移至34℃,分别于12 h、18 h和24 h统计存活率(N=3个生物学实验,p<0.05,t检验)。在a-d,g,h,j和k中,数值表示为平均值±SEM。(原文图2)


3、Probio-M9的健康促进作用取决于其对宿主肠道的粘附


益生菌与肠上皮细胞的粘附和肠道益生菌的积累是维持宿主肠道菌群内稳态的重要前提。为了评估Probio-M9对线虫肠道健康的影响,研究了特定发育阶段OP50+Probio-M9喂养对线虫寿命的影响,并测试了Probio-M9在线虫肠道内的附着能力。在OP50+Probio-M9上将虫卵培养至L4期或成虫(L4后第2天或第4天),与喂食OP50的虫卵相比,其寿命明显更长(图4a-e和补充表3)。此外,在OP50+Probio-M9上从虫卵培养至成虫的寿命显著长于从虫卵培养到L4期的线虫(图4f和补充表3)。这些结果表明,延长寿命的程度取决于线虫发育周期中Probio-M9喂养的时间。
为了验证Probio-M9在线虫肠道中的附着效果,评估了Probio-M9在成虫后第5天和第10天粘附在肠道上的能力。喂食OP50+Probio-M9 5或10天后,使用肠道内积累的细菌数量确定菌落总数(CFU)。在第5天和第10天,Probio-M9的数量(分别为217 CFU/mL/worm和793 CFU/mL/worm)与阳性对照鼠李糖乳杆菌GG (LGG,分别为166 CFU/mL/worm和872 CFU/mL/worm)相似(图4g)。为了证实Probio-M9较好的附着于线虫肠道内,本研究还检测了OP50+Probio-M9或OP50+LGG喂食10天线虫转移至OP50继续喂食3天后的附着能力。在先前喂食OP50+Probio-M9的线虫中,Probio-M9菌落总数为667 CFU/mL/虫,与LGG组的747 CFU/mL/虫相似(图4h)。这些结果表明,Probio-M9存在于线虫的肠道中,有助于宿主的健康寿命。

此外,研究了热灭活Probio-M9(95℃,30min)对线虫寿命的影响。发现,OP50+热灭活的Probio-M9无法延长线虫的寿命(图4i和补充表3),这表明活菌状态的Probio-M9才能延长线虫寿命。综上所述,Probio-M9的健康促进作用与线虫的肠道附着有关。

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图4 Probio-M9的存活率和宿主积累能力。a,c 图解说明了每次试验中使用的方法和细菌。漂白后,将卵转移到菌圈(OP50或OP50+Probio-M9)中,让其发育到L4后期或成虫(L4期后第2天或第4天)。b,d,e OP50或OP50+ Probio-M9饲喂至L4后期(b)、L4期后第2天(d)和L4期后第4天(e)的生存曲线(N=90只,p<0.05,对数秩检验)。f 在L4期后第4天喂食OP50+Probio-M9显著延长了寿命,而在L4期后第2天与喂食OP50+Probio-M9至L4期相比无显著差异(N=3个生物学实验,p<0.05,t检验)。g 菌落形成表明,Probio-M9与LGG相似地附着在线虫的肠道上(N=3个生物学实验,p>0.05,t检验)。第5天或第10天从有试验细菌的NGM平板上收集线虫,计数细菌CFU数量,表示为每只线虫的CFU。OP50和LGG作为对照。h Probio-M9对线虫肠道的积累。先用Probio-M9或对照(OP50和LGG)喂食10 d,然后转移到添加OP50的新板上。3 d后计算线虫肠道中CFU的数量,表示为每只线虫的CFU,结果表明,Probio-M9仍然附着在线虫的肠道上(N=3个生物学实验,p>0.05,t检验)。在f-h中,数值表示为平均值±SEM。i 热灭活Probio-M9(95℃ 30 min)未能延长野生型N2线虫的寿命(N=90只,p>0.05,对数秩检验)。(原文图3)


4、Probio-M9通过p38 MAPK信号通路发挥作用


为明确Probio-M9益生特性的分子机制,本研究探究了经典的p38信号通路,是进化保守的MAPKs亚家族信号通路,在宿主寿命调节中发挥重要作用。利用线虫突变体,首先研究了p38级联反应中的三个关键因子NSY-1、SEK-1和PMK-1是否与Probio-M9喂养诱导的宿主寿命有关。有趣的是,nsy-1(ag3)和pmk-1(km25)突变几乎完全抑制了与喂食Probio-M9相关的寿命延长,sek-1(km 4)突变不完全抑制寿命延长(N2中约30%的寿命延长vs sek-1突变中约12%的寿命延长)(图5a-c和补充表4),这表明线虫p38信号通路参与了Probio-M9介导的寿命延长。

为了进一步验证p38信号通路的作用,评估了Probio-M9对Toll-白细胞介素-1受体结构域的效应蛋白(TIR-1)、tir-1(tm3036)和tir-1(ok1052)两种突变体寿命的影响,这两种突变体在线虫的PMK-1上游起作用。同样,OP50+Probio-M9不能延长任何突变体的寿命(图5d,e和补充表4)。为了进一步证实,探索了Probio-M9对ATF-7的影响,ATF-7是p38信号通路中作用于PMK-1下游的转录因子。同样,OP50+Probio-M9不能延长atf-7(gk715)突变体的寿命(图5f和补充表4),表明Probio-M9可能通过PMK-1激活ATF-7来延长线虫的寿命。总之,Probio-M9通过激活p38信号通路延长线虫寿命。

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图5 Probio-M9作用于p38 MAPK信号通路延缓衰老。a-f p38 MAPK信号通路突变体nsy-1(ag3)(a)、sek-1(km4)(b)、pmk-1(km 25)(c)、tir-1(tm3036)(d)、tir-1(ok1052)(e)和atf-7(gk715)(f)在Probio-M9喂养后的存活曲线(N=90只,p>0.05,对数秩检验)。(原文图4)


5、Probio-M9下调胰岛素样信号通路


宿主和益生菌之间在促进长寿方面的相互作用是复杂和多因素的。我们想知道Probio-M9是否可能通过宿主中的一种众所周知的营养感应机制发挥作用。利用IIS中功能缺失突变体和雷帕霉素(TOR)靶蛋白信号通路的线虫,通过喂食Probio-M9研究了这些宿主因子是否与线虫寿命相关。在测试的4个突变体中,只有daf-2(e1370)突变体在喂食OP50+Probio-M9后未能表现出延长寿命(图6a,b,补充图2a,b和补充表5,6)。这一结果表明,Probio-M9延长寿命的机制涉及IIS信号通路,但不涉及TOR信号通路。
DAF-2是IIS的上游成分,调节多种生理过程。为了确定Probio-M9在寿命调控中如何与IIS信号通路相互作用,检测了DAF-2下游转录因子HSF-1(热休克转录因子1)、SKN-1/ nuclear factor erythroid 2(NRF2)和DAF-16/FOXO在寿命延长中的潜在参与。发现Probio-M9介导的线虫寿命延长不依赖DAF-16,但依赖于SKN-1和HSF-1(图6c-e和补充表5),表明Probio-M9的延长寿命可能需要SKN-1与HSF-1。

SKN-1和HSF-1作为抗应激转录因子发挥作用。为了确认喂食Probio-M9是否提高了线虫的抗逆性,延长了线虫的寿命,因此研究了两个GFP报告基因skn-1::gfp(skn-1的转录靶点)和hsp-16.2p::gfp(hsf-1的直接转录靶点),分别反映了SKN-1和HSF-1的抗逆性。结果表明,饲喂OP50+Probio-M9的线虫肠道中skn-1::gfp的表达增加,但对hsp-16.2p::gfp没有影响(图6f-i)。此外,检测了SKN-1活性指标GST-4的表达,结果表明,与喂食OP50的线虫相比,喂食OP50+Probio-M9的线虫中gst-4p::gfp的表达增加(图6j,k)。因此,Probio-M9通过一种依赖于skn-1(而非hsf-1)的机制影响寿命延长和抗应激能力。

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图6 Probio-M9诱导的寿命延长与胰岛素样信号通路的下游效应因子相关。a-e 喂食Probio-M9的胰岛素样信号通路突变体daf-2(e1370)(a)、age-1(hx546) (b)、daf-16(mgDf50)(c)、skn-1(mg570)(d)和hsf-1(sy441)(e)的寿命(N=90只,p>0.05,p<0.0001,对数秩检验)。分别用应激响应报告基因skn-1::GFP (f)和hsp-16.2::GFP (h)测试SKN-1和HSF-1。第5天,在34℃下加热20分钟,诱导hsp-16.2p::GFP报告基因表达。g,i 用ImageJ软件量化GFP的荧光强度。在OP50+Probio-M9上生长的skn-1::GFP(g)线虫的肠道荧光强度增加(N=30只,p<0.01,t检验)。Probio-M9对HSF-1(i)应激诱导反应没有影响(N=30只,p>0.05,t检验)。j,k 饲喂OP50+Probio-M9后,SKN-1活性指标GST-4的表达增加。在第5天检测gst-4p::gfp的表达(j),用ImageJ软件测量荧光强度(k) (N=30只,p<0.01,t检验)。在f,h和j中,比例尺为20 μm。在g,i和k中,结果以任意单位(a.u.)表示,值以平均值±SEM表示。(原文图5)


6、Probio-M9作用于宿主线粒体以延长寿命


为了进一步探讨Probio-M9抗应激作用的分子机制,研究了其他两种细胞器特异性应激反应——内质网未折叠蛋白反应(UPRER)和UPRmt。Probio-M9不影响UPRER中应激基因GFP报告基因(hsp-4p::gfp)的诱导(补充图3a,b),但对线粒体应激有影响。特别是在喂食OP50+Probio-M9的线虫肠道和尾部,hsp-6p::gfp的表达增加(图7a,b),表明喂食Probio-M9诱导了UPRmt
为了证实已知激活UPRmt的分子成分的参与,首先检测了ATFS-1,一种在UPRmt调节中的关键转录因子。正如预期那样,OP50+Probio-M9无法延长atfs-1(gk3094)功能缺失突变体的寿命(图7c和补充表7)。还检测了Probio-M9对功能缺失突变体isp-1(qm150)和nuo-6(qm200)的影响,以评估ETC的成分isp-1nuo-6是否与Probio-M9介导的宿主寿命促进相关。同样,OP50+Probio-M9无法延长isp-1(qm150)或nuo-6(qm200)突变体的寿命(图7d,e和补充表7),这表明Probio-M9的寿命延长作用与线虫线粒体功能降低的促长寿作用一致。因此,Probio-M9通过增强UPRmt,从而维持肠细胞线粒体内稳态,延长了宿主的寿命。

为了评估Probio-M9对线粒体膜电位的影响,使用了线粒体特异性荧光染料四甲基罗丹明乙酯(TMRE)对线虫进行染色。与OP50相比,喂食OP50+Probio-M9的线虫咽部荧光强度显著增加(图7f,g),表明Probio-M9增加了宿主的线粒体膜电位。由于细胞膜上的膜电位是线粒体产生ATP的主要动力,喂食Probio-M9可能有助于线虫细胞和体内ATP的产生和储存。

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图7 Probio-M9作用于宿主线粒体以促进健康寿命。a,b 用线粒体报告蛋白hsp-6p::gfp检测UPRmthsp-6p::GFP的代表性显微照片如图a所示,使用ImageJ软件量化hsp-6p::GFP的荧光强度(b)。在OP50+Probio-M9上生长的hsp-6p::GFP线虫对肠道和尾部的应激反应能力增强(N=40只,p<0.05,t检验)。c 在UPRmt转录因子atfs-1(gk3094)突变体中,Probio-M9赋予的寿命延长被完全废除(N=90只,p>0.05,对数秩检验)。d,e Probio-M9不能延长线虫ETC成分isp-1(qm150)(d)和nuo-6(qm200)(e)突变体的寿命(N=90只,p>0.05,对数秩检验)。f,g 使用TMRE对OP50或OP50+Probio-M9喂养的线虫进行染色,以显示线粒体膜电位。取咽部(f),任意单位的TMRE荧光强度的统计分析如图g所示(N=30只,p<0.001,t检验)。在a和f中,比例尺为20 μm。在b和g中,结果以任意单位(a.u.)表示,值以平均值±SEM表示。(原文图6)


7、OP50与Probio-M9差异代谢物的鉴定与分析


为了阐明Probio-M9介导的长寿机制,使用超高效液相色谱-质谱进行了代谢组学分析,以确定OP50和Probio-M9之间的差异调节代谢物。采用总离子流图(TIC)和主成分分析法(PCA)对试验中采集的质控细菌数据进行分析评价。样品的TIC在阳性和阴性下进行测试。分析表明,在比较各色谱峰的保留时间和强度时,存在高度重叠,反映了仪器的高稳定性(补充图4a,b)。PCA评分显示,混合质控细菌(mix01,mix02和mix03)聚集良好,但与OP50和OP50+Probio-M9分离,表明实验条件和数据的重复性稳定可靠(补充图4c)。

共鉴定和量化了1253个代谢物。采用PCA、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)模型和热图评估OP50和OP50+Probio-M9之间的代谢变化。PCA评分、OPLS-DA评分图和热图显示,OP50和OP50+Probio-M9分布在不同区域,没有重叠和交叉,而是有明显的分离(图8a-c)。当代谢产物水平的变化同时满足差异倍数值(FC)≤0.5或≥2和变量重要性指标(VIP)评分阈值≥1的标准时,认为OP50和OP50+Probio-M9之间差异调节代谢产物具有统计学意义。然后用火山图表示这些代谢物(图8d),详细内容见补充数据1。将差异显著的代谢物分为氨基酸及其代谢物、羧酸及其衍生物、有机酸及其衍生物、鞘脂类、核苷酸及其代谢物、苯及其衍生物、杂环化合物等14大类。Log2FC值在OP50和OP50+Probio-M9之间的前十个上调和前十个下调代谢产物如图8e所示,反映了这些通路中代谢产物的变化水平。为了将Probio-M9相关变化与代谢途径相关联,使用KEGG数据库确定具有显著差异的代谢物的途径富集模式。82条代谢途径被确定为受代谢改变的影响(补充图4d),其中20个显著变化的代谢物有助于色氨酸代谢、脂肪酸生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、铁沉降、半乳糖代谢和鞘脂代谢相关途径的富集(图8f),表明这些途径可能有助于Probio-M9介导的宿主寿命延长。

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图8 OP50和Probio-M9之间代谢谱的比较。a-c 代谢产物的PCA评分(a)、OPLS-DA评分图(b)和热图(c)显示OP50与OP50+Probio-M9之间差异显著,无重叠和交叉,存在明显分离。d 火山图显示了OP50和OP50+Probio-M9之间的显著代谢物。与OP50相比,紫色点表示随OP50+Probio-M9(上调)而增加的代谢物,蓝色点表示OP50+Probio-M9(下调)而减少的代谢物,红色点表示没有随OP50+Probio-M9的改变而改变的代谢物(不显著)。e OP50和OP50+Probio-M9之间变化最大的10个代谢物。与OP50相比,红色条代表OP50+Probio-M9上调的代谢产物,绿色条代表OP50+Probio-M9下调的代谢产物。f OP50与OP50+Probio-M9之间发生显著变化的代谢产物的KEGG富集分析(点的颜色代表p值,颜色越红,富集程度越显著;点的大小表示该通路中富集的代谢物的数量)。(原文图7)


讨论


本研究发现,喂食母乳源鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9,可以延长模式生物秀丽隐杆线虫的寿命(图9)。喂食活菌状态的Probio-M9,而不是热灭活Probio-M9,可以改善线虫的健康。Probio-M9通过调节p38级联和daf-2信号通路延长线虫的寿命,不依赖daf-16,但依赖于skn-1。通过激活UPRmt,保护和修复受损的线粒体,以维持代谢的稳定。同时,氨基酸代谢、鞘脂代谢、半乳糖代谢和脂肪酸代谢可能参与了Probio-M9介导的线虫寿命。

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图9 线虫中喂养Probio-M9调控的信号通路示意图。活的Probio-M9喂食通过胰岛素/IGF-1信号通路(DAF-2/SKN-1)和p38 MAPK信号通路(NSY-1-SEK-1-PMK-1)延长线虫的寿命。它还触发线粒体未折叠蛋白反应(UPRmt)以维持线粒体内稳态。因此,喂养Probio-M9可以通过提高线虫的抗应激能力、激活防御系统、提高UPRmt来延长其寿命。(原文图8)


DR已被证明在多种物种中可以延长寿命和延缓衰老。尽管DR可以延长线虫的寿命,但同时使线虫发育迟缓。在本研究中,OP50+Probio-M9喂养的线虫体型和发育正常,发育周期与OP50喂养的相似。此外,OP50+Probio-M9的喂养延长了DR信号通路的ate-2(ad1116)和aak-2(ok524)功能缺失的突变体的寿命,表明Probio-M9以不依赖DR的方式延长了线虫的寿命。

肌肉功能下降和脂褐素积累与衰老密切相关。研究表明,喂食Probio-M9增强了老年线虫的运动能力,减少了脂褐素的积累,表明Probio-M9延长了宿主的健康寿命。此外,在成年后的第5天,喂食OP50+Probio-M9的线虫在高温(34℃)下的存活率明显高于喂食OP50的线虫,这表明喂食Probio-M9使线虫具有更强的耐受环境压力的能力。本研究证明了Probio-M9的喂养可以增强线虫的应激反应,延长其寿命,为进一步研究Probio-M9延缓宿主衰老过程提供了理论基础。
本研究还表明,Probio-M9延长寿命的程度取决于Probio-M9的喂养时间。此外定量CFU分析显示,在从OP50+Probio-M9转变为OP50喂养后,线虫中依然存在Probio-M9,类似于阳性对照LGG。然而,OP50+热灭活的Probio-M9不能延长线虫的寿命,这表明活菌状态的Probio-M9对宿主的健康有有益的影响,可以延长线虫的寿命,这与益生菌的定义一致。相比之下,先前的报告显示,长双歧杆菌长亚种BB在95℃ 30min灭活下可显著延长线虫寿命28%,表明益生菌可能具有菌株特异性。总之,Probio-M9对线虫的健康促进和寿命具有有益的作用,这些作用取决于Probio-M9对线虫肠道的附着。
OP50+Probio-M9不能延长pmk-1功能缺失突变体的寿命,表明p38级联可能与Probio-M9喂养相关的寿命有关,这与之前关于鼠李糖乳杆菌GG通过激活pmk-1(p38 MAPK)信号通路延长线虫寿命的报道一致。TIR-1可以激活下游PMK-1信号通路。我们的数据表明,OP50+Probio-M9通过激活p38信号通路上游的TIR-1延长了线虫的寿命。此外,作用于p38信号通路下游的ATF-7对线虫具有双重免疫调节作用。ATF-7抑制免疫相关基因的转录。然而,当p38(PMK-1)磷酸化发生时,这种抑制被消除,之后ATF-7作为激活剂,促进免疫基因的激活。OP50+Probio-M9不能延长atf-7功能缺失突变体的寿命,表明先天免疫模式识别系统可能参与了Probio-M9激活的p38级联反应。通常大肠杆菌被用作秀丽线虫培养物的唯一膳食补充剂;然而,增殖细菌可能对较老的线虫具有致病性。因此,摄入Probio-M9可能通过PMK-1激活宿主防御系统,发挥其促进健康的作用。
SKN-1控制特定的抗应激途径,也广泛参与免疫反应、代谢和解毒。OP50+Probio-M9不能延长skn-1功能缺失突变体的寿命,表明skn-1可能是Probio-M9介导的延长寿命所必需的。SKN-1被DAF-2直接抑制,通过SKN-1活性的DAF-2信号通路可能调控Probio-M9饲养的线虫的寿命。在OP50+ Probio-M9喂养的线虫肠道中,SKN-1的荧光强度明显强于OP50,也增加了线虫skn-1的下游靶点gst-4p::gfp的表达,说明Probio-M9喂养激活了其SKN-1,从而提高了其抗应激能力,延长了寿命。
线粒体参与衰老过程,是代谢和重要信号通路的信号枢纽。Probio-M9可能通过线粒体ETC组分ISP-1和NUO-6提高了肠道UPRmt水平并延长了线虫的寿命。线粒体ETC复合体功能的降低有助于激活UPRmt以维持线粒体内稳态。UPRmt激活的ATFS-1反过来抑制线粒体基因组中ETC基因的表达。ATFS-1也是Probio-M9促进健康作用的关键调节因子。
细菌代谢产物在宿主衰老过程中起着至关重要的作用。本研究代谢组学分析发现,差异表达的代谢物主要富集在氨基酸代谢、半乳糖代谢、鞘脂代谢、脂肪酸生物合成和cAMP信号通路中。氨基酸影响宿主寿命,色氨酸和脯氨酸延缓线虫衰老,苯丙氨酸加速线虫衰老;天冬氨酸,谷氨酸和蛋氨酸延长酵母的寿命。因此,色氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢物的显著富集可能与Probio-M9延长秀丽线虫寿命有关。葡萄糖代谢物,如葡萄糖、半乳糖和乳糖,也可能与宿主寿命有关,参与抗衰老活性。代谢组学数据表明Probio-M9显著富集半乳糖代谢产物可能有助于延缓线虫衰老。鞘脂、神经酰胺等细菌代谢物的积累与衰老及年龄相关疾病发生密切相关。研究表明,鞘脂代谢可能对线虫运动能力的增强和健康状况的改善具有重要作用,其部分依赖于胰岛素受体daf-2信号通路。Probio-M9可能通过营养感应调节鞘脂代谢,从而延长线虫的寿命。此外,喂食OP50+Probio-M9后,牛磺酸代谢产生的2-氨基乙磺酸显著积累。牛磺酸在清除脂质代谢、免疫功能等生理功能方面具有重要意义,是抗炎活性的重要促进剂。然而,这种推断需要进一步的实验验证。提取Probio-M9中最关键的代谢物,并进行进一步的寿命验证实验,以证明益生菌代谢物对宿主的健康促进和延长寿命的作用。因此,有必要明确益生菌的主要抗衰老成分,并探索益生菌延缓宿主衰老的信号通路。

结论


本研究发现母乳源益生菌鼠李糖乳酪杆菌Probio-M9可增强线虫的运动能力,减缓其肌肉功能衰退。通过筛选各种与衰老相关的线虫突变体,研究了Probio-M9延长寿命的分子机制。结合Probio-M9代谢产物的差异表达,揭示了Probio-M9延缓宿主衰老的可能代谢通路。为进一步分析益生菌在改善宿主健康和延缓衰老相关慢性疾病发生方面提供了新的方法和见解。






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